Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología Vegetal

Universidad de Málaga

Identificación de genes esenciales para la tolerancia a estrés hídrico y salino

Resumen

Son pocos los genes esenciales en la tolerancia a estrés hídrico y salino identificados en plantas. Usando una aproximación genética hemos identificado 5 mutantes de tomate (mutantes tss) hipersensibles a NaCl así como 1 mutante de tomate (mutante tos1) y un mutante de Arabidopsis (mutante dry1) hipersensibles específicamente a estrés osmótico. En este proyecto se pretende realizar una caracterización fisiológica y molecular de estos mutantes con el fin de definir genes y procesos críticos en la tolerancia a estrés hídrico y salino en plantas. El análisis de la expresión génica de los mutantes usando “microarrays” y “northerns” determinará qué genes tienen afectada su expresión en los mutantes. La clonación de los genes DRY1 y TOS1 son objetivos prioritarios del proyecto. Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que el gen DRY1 es un gen esencial para la tolerancia a sequía a largo plazo. Este gen ya se ha localizado en el cromosoma 1 de Arabidopsis y su clonación está cercana. Se determinará en detalle la expresión de este gen así como el fenotipo resultante de la sobreexpresión del mismo. También en este proyecto se sentarán las bases para la clonación del gen de tomate TOS1. Este gen es esencial para la tolerancia a estrés hídrico así como para la percepción intracelular de ABA. Con el fin de clonar TOS1  se ha realizado un cruzamiento entre el mutante tos1 en Lycopersicon esculentum y una entrada del parental polimórfico Lycopersicon pimpinellifolium. Durante este proyecto se identificarán marcadores AFLP ligados al gen y se creará un contiguo físico que comprenda el mismo. La clonación de  TOS1 dependerá de la obtención durante el presente proyecto de eventos de recombinación lo suficiente cercanaos al gen para permitir su identificación.

 

Abstract

Only a reduced number of genes have been identified as critical for plant salt and drought tolerance. Using a genetic approach we have identified 5 tomato mutants (tss) hypersensitive to NaCl as well as 1 tomato (tos1) and 1 Arabidopsis (dry1) mutants specifically hypersensitives to drought stress. In this project we will characterize physiologically and molecularly these mutants in order to define genes and critical processes for salt and drought tolerance in plants. Analyses of gene expression of these mutants using northern and microarray analyses will determine which genes are affected in their expression in these mutants. Cloning of DRY1 and TOS1 are important objectives in the present proposal. Previous studies in our laboratory has shown that the DRY1 gene is essential for long term drought tolerance. This gene has been mapped on chromosome 1 and we are close to the cloning of the gene. We will analyze the expression of DRY1 gene by northern and promoter-reporter analysis and study the phenotype resulting of the overexpressing of this gene. We will initiate the cloning of TOS1. This gene is essential for drought tolerance and intracellular ABA perception. With the aim of cloning TOS1 we have crossed the tos1 mutant (in L. esculentum) with an accession of the polymorphic parent L. pimpinellifolium. In the course of the present project we will identify AFLP markers linked to TOS1 and a physical contig covering the gene will be obtained. The cloning of TOS1 during the present project will depend on the identification of recombination events close enough to the gene.

 

ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL

El estudio de la respuesta de las plantas a los factores ambientales adversos y los mecanismos adaptativos que éstas ponen en juego es extremadamente complejo y requiere un análisis pluridisciplinar. Ello es así por el carácter polifacético del estrés abiótico que a su vez  desencadena una respuesta multifactorial en las plantas. Por ejemplo, una salinidad excesiva del suelo (fenómeno frecuentemente asociado a la agricultura de regadío en clima semiárido) provoca toxicidad iónica, déficit hídrico, deficiencias nutricionales y estrés oxidativo.

En el caso de la salinidad se inhibe el crecimiento de las plantas mediante mecanismos distintos aunque relacionados entre sí tales como la alteración del equilibrio hídrico producido por el efecto osmótico de la sal sobre la disponibilidad de agua en el suelo, el efecto tóxico sobre la fotosíntesis inducido por la acumulación de iones salinos en los tejidos foliares, y el desequilibrio nutricional debido a las interferencias de los iones salinos con la absorción de elementos nutritivos ensenciales como el K+ o el Ca2+. En el caso del estrés hídrico, su efecto inhibidor sobre el crecimiento de la planta radica por una parte, en el coste metabólico que supone la degradación de compuestos orgánicos y la síntesis de osmolitos compatibles necesarios para mantener la turgencia celular, y por otra parte en el menor abastecimiento del CO2, necesario en la fotosíntesis, que se produce cuando se cierran los estomas como consecuencia de la reducción del potencial hídrico y/o del aumento del contenido foliar de ácido abcísico (ABA).

Conseguir plantas más tolerantes a salinidad y sequía es un objetivo prioritario de muchos programas de investigación actualmente en marcha. Las herramientas para desarrollar plantas transgénicas están bien desarrolladas. Sin embargo, el factor limitante en el uso biotecnológico para mejorar la tolerancia a estreses abióticos es precisamente la falta de conocimiento sobre los genes que puedan producir tolerancia. Tres son las aproximaciones más comunes que se han usado para identificar genes implicados en la tolerancia.

Una aproximación bioquímica que se basa en el conocimiento previo de una enzima particular o ruta metabólica importante en la tolerancia al estrés. Los genes implicados en esta ruta se podrían considerar como genes de tolerancia. Por ejemplo, la acumulación de metabolitos denominados compatibles como prolina, betaína  o polialcoholes es importante en el ajuste osmótico y también en la protección de estructuras celulares en condiciones de estrés. Asumiendo que la acumulación de osmolitos compatibles es importante, los genes que codifican las enzimas responsables de su síntesis se pueden considerar genes de tolerancia.

Una segunda aproximación estudia la expresión de genes en condiciones de estrés y las compara con la expresión de los mismos genes en ausencia de estrés. Genes que muestran  un incremento de  su expresión en condiciones estrés se clonan usando diversos métodos sustractivos. Esta aproximación presenta una serie de problemas importantes. En primer lugar, muchos de estos genes no se expresan como respuesta al estrés sino como consecuencia del mismo. En segundo lugar, es posible que muchos de los genes de tolerancia no alteren su expresión a consecuencia del estrés por lo que no es posible identificarlos.

La tercera aproximación es genética, y es en nuestra opinión la más poderosa. Se basa en el uso de mutantes monogénicos recesivos que tengan alterado un solo mecanismo de adaptación. Estos mutantes son una herramienta muy útil para identificar los genes y procesos esenciales en la tolerancia al estrés.

Esta última aproximación ya se ha empleado con éxito en la identificación de genes esenciales en la tolerancia a NaCl en levaduras (Mendoza et al., 1994). Más recientemente, la identificación de mutantes de Arabidopsis ha permitido la localización y clonación de genes asociados a la tolerancia a salinidad. El cribado de más de 250.000 semillas mutagenizadas de Arabidopsis ha permitido identificar 44 mutantes hipersensibles a NaCl (Zhu et al., 1998). Estudios de complementación genética han determinado que estos mutantes forman 3 grupos de complementación por lo que definen tres genes distintos (denominados SOS por Salt Overly Sensitive). Los genes SOS1, SOS2, y SOS3 son necesarios para la tolerancia al estrés impuesto por sodio. Caracterizaciones fisiológicas posteriores determinaron estos mutantes eran incapaces de crecer en concentraciones micromolares de K⁺ lo que sugería que el mecanismo de transporte de alta afinidad de K⁺ se encuentra afectado en estos mutantes. La clonación de los genes SOS sin embargo no ha aclarado el por qué de esta deficiencia de crecimiento a baja concentración de K⁺, puesto que SOS1 es un transportador de Na⁺ y SOS2 y SOS3 son proteínas que regulan la actividad de SOS1 (Zhu, 2000). Estudios recientes de las proteínas SOS en levaduras indican que estas tres proteínas son suficientes para reconstituir la transmisión de señal que regula la homeostasis de Na⁺ (Quintero et al., 2002)

 

FINALIDAD DEL PROYECTO

Los resultados de las aproximaciones genéticas en Arabidopsis abren una serie de interrogantes esenciales en este campo de la investigación. 1) ¿Es la toma de potasio un elemento clave en la tolerancia a salinidad en otras especies y en particular en especies de interés comercial como el tomate? 2) ¿Por qué todos los mutantes hipersensibles a NaCl identificados en Arabidopsis están implicados en la nutrición de K⁺?, en otras palabras, ¿es posible identificar genes esenciales en la tolerancia a NaCl implicados en otros procesos como compartimentalización iónica, síntesis de osmolitos compatibles, transmisión de señal, señalización o percepción de ácido abcísico u otro proceso aún sin determinar? 3) ¿Por qué todos los mutantes de Arabidopsis identificados son mutantes iónicos y no se han identificado mutantes osmóticos?.

 

RESULTADOS OBTENIDOS POR NUESTRO LAB

Identificación de mutantes de tomate  hipersensibles a NaCl (tss). Usando un protocolo similar al empleado en ArabidopsiS (Borsani et al., 2001a) se ha realizado un cribado en 2600 familias mutagenizadas de tomate. Puesto que se han analizado unas 30 plantas por familia esto ha supuesto el cribado de unas 60000 plantas de tomate en total usando NaCl. Hasta la fecha se han identificado 9 mutantes tss (por tomato salt sensitive). Estudios de complementación genética de estos mutantes han determinado que se dividen en 5 grupos de complementación (tss1 a tss5). Estos mutantes son hipersensibles específicamente a Na⁺. Sólo el mutante tss2 es además hipersensible a estrés osmótico (Borsani et al., 2001a). Los mutantes tss1, tss4 y tss5 tienen una deficiencia de crecimiento a concentraciones micromolares de K⁺. Esto indica que la toma de K⁺ es esencial para la tolerancia a NaCl en tomate además de Arabidopsis. Medidas del potencial de membrana en células de raíz usando electrofisiología indican que el mutante tss1 tiene disminuida su capacidad para absorber K⁺, aunque no se han observado diferencias en la absorción de Na⁺ (Borsani et al., 2001a). Estas observaciones indican que el locus TSS1 es esencial para la absorción de K⁺ y por consiguiente podría estar involucrado en el mantenimiento del balance nutricional Na⁺/K⁺, que es un factor determinante de la tolerancia a la salinidad en plantas adultas de tomate. tss1 se comporta en ciertos aspectos como una fenocopia del mutante de Arabidopsis sos3, puesto que el menor crecimiento con K⁺ se elimina con altas concentraciones de Ca²⁺, lo que sugiere que al igual que SOS3, TSS1 podría codificar un sensor de Ca²⁺. Nuestros estudios más recientes, no publicados aún, indican sin embargo diferencias importantes entre el mutante tss1 y sos3, sugiriendo que o bien no son genes ortólogos o que existen diferencias fundamentales en la nutrición de K⁺ entre Arabidopsis y tomate. Los mutantes tss2 y tss3 son hipersensibles a Na⁺ si bien no se ha determinado el motivo de esta hipersensibilidad. El mutante tss2 es además hipersensible a estrés osmótico. Esta hipersensibilidad a estrés osmótico está asociada a una mayor hipersensibiliad a ácido abcísico (ABA), lo que indica que TSS2 es un regulador negativo de la vía de transmisión de señal de ABA. Además TSS2 es un nexo de unión entre las vía de ABA y etileno, pues la inhibición de la acción de etileno hace que el mutante tss2 deje de ser hipersensible a estrés osmótico y a ABA.

Identificación de un mutante de tomate hipersensible a estrés osmótico (tos1). Al igual que en Arabidopsis, todos los mutantes identificados empleando NaCl como agente estresante en el cribado son mutantes iónicos. Con el fin de identificar mutantes osmóticos puros se ha utilizado manitol en lugar de NaCl. Como resultado de un cribado de las mismas 2000 familias de tomate analizadas previamente se ha identificado el mutante tos1 (por tomato osmotic sensitive) (Botella et al., 2001). Este mutante recesivo es hipersensible a estrés osmótico y solo hipersensible a altas concentraciones de NaCl, lo que explica que no se identificara en el cribado con NaCl. En condiciones de estrés osmótico el contenido de prolina  del mutante tos1 es similar al determinado en el genotipo silvestre. Esto sugiere que este componente de la respuesta al estrés osmótico no está afectada en el mutante. Este mutante es menos sensible al ABA intracelular y esta menor sensibilidad es una característica celular expresada en todas las etapas de desarrollo. La sensibilidad reducida a ABA por parte de tos1 no se debe a una deficiencia en la síntesis de ABA puesto que el mutante acumula más ABA que el genotipo silvestre en condiciones de estrés osmótico. Estos datos indican que el alelo silvestre de TOS1 es necesario para una señalización correcta de ABA así como para tolerancia a estrés osmótico y es, muy posiblemente, un componente positivo de la vía de transmisión de señal de ABA. Del fenotipo que confiere la mutación en TOS1 se puede especular en la función del gen. Una hipótesis actual en la transmisión de señal de ABA es que éste actúa a través de una cadena de transmisión de señal iniciada por la unión del ABA a su receptor (Bonetta y McCourt, 1998). La disminución en la sensibilidad al ABA sugiere que TOS1 codifica un componente en la transmisión de señal lo que hace al gen TOS1 muy interesante. Es importante indicar que tos1 es un mutante con un comportamiento frente a ABA no descrito en ningún otro mutante, por lo que es de esperar que la secuencia de TOS1 no presente homología a ninguna proteína de las que hasta el momento han sido implicadas en la señalización de ABA. Con el fin de clonar el gen tos1  se ha generado una población recombinante a partir de un cruce entre tos1 (Lycopersicon esculentum) y el parental polimórfico Lycopersicon pimpinellifolium.

Identificación de un mutante de Arabidopsis hipersensible a estrés osmótico (dry1). Una vez que se determinó la posibilidad de identificar mutantes puramente osmóticos de tomate usando manitol se siguió una estrategia similar con Arabidopsis. Como resultado de un cribado de 45.000 plantas M2 mutagenizadas con etil-metano-sulfonato se identificó el mutante denominado dry1 (por drought hypersensitive) (Borsani et al., 2001c). El crecimiento de la raíz de dry1 es hipersensible a estrés osmótico pero no lo es a NaCl. El defecto de dry1 parece ser independiente de ABA, puesto que tanto su crecimiento radical con ABA exógeno como el contenido endógeno de ABA son similares al silvestre. Plantas adultas dry1 sólo son hipersensibles a estrés osmótico cuando éste se aplicó lentamente. Cuando el estrés aplicado fue muy drástico no se observaron diferencias con el silvestre sugiriendo que es la adaptación a largo plazo la que se encuentra afectada en el mutante. Además, cuando a dry1 se le somete a una iluminación muy intensa ocurre una necrosis que acaba siendo letal. Este fenotipo sugiere que dry1 tiene afectado su tolerancia a estrés oxidativo, algo que se ha demostrado que ocurre en Arabidopsis como consecuencia del estrés salino (Borsani et al., 2001b). Los niveles de RNA mensajero de varios genes relacionados con tolerancia a estrés osmótico se encuentran afectados en el mutante, lo que sugiere que DRY1 es un gen necesario para la transmisión de la señal implicada en la tolerancia a estrés osmótico a largo plazo. Se ha iniciado la clonación posicional del gen DRY1. Para ello se ha generado una población recombinante y analizado marcadores en los cinco cromosomas  con el fin de identificar marcadores asociados a la mutación. Como resultado se ha localizado la mutación dry1 entre los marcadores m235 y nga248, a 31,9 y 42 centimorgans respectivamente en el cromosoma 1.

REFERENCIAS

Bonetta D y McCourt P (1998). Genetic analysis of ABA signal trasduction pathways. Trends Plant Sci. 3, 231-235.

Borsani O, Cuartero J, Fernández JA, Valpuesta V, y Botella MA (2001a). Identification of two loci in tomato reveals distinct mechanisms for salt tolerance. Plant Cell, 13: 873-888.

Borsani O, Valpuesta V, y Botella MA (2001b) Evidence for a role of salicylic acid in the oxidative damage generated by NaCl and osmotic stress in Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Physiology, 126: 1024-1030

Borsani O, Valpuesta V, y Botella MA (2001c) Arabidopsis mutation dry1 identifies a gene essential for drought tolerance.  En  Molecular Basis of Ionic Homeostasis and Salt Tolerance in Plants. Instituto Juan March.

Botella MA, Borsani O, Cuartero J, y Valpuesta V (2001) Delimiting the osmotic component of salt stress. En  Molecular Basis of Ionic Homeostasis and Salt Tolerance in Plants. Instituto Juan March.

Botella MA, Parker JE, Frost LE, Bittner-Eddy PD, Beynon JL, Daniels MJ, Holub EB y Jones JDG. (1998). Three genes of the Arabidopsis RPP1 complex resistance locus recognize distinct Peronospora parasitica avirulence determinants. Plant Cell, 10: 1847-1860.

Mendoza I, Rubio F, Rodriguez Navarro A y Pardo JM (1994) The protein calcineurin is essential for NaCl tolerance of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 269: 8792-8796.

Quintero, FJ, Ohta M, Shi H, Zhu J-K y Pardo JM (2002) Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na⁺ homeostasis. En revisión en PNAS.

Zhu, J-K. (2000) Genetic analysis of plant salt tolerance using Arabidopsis. Plant Physiology, 124: 941-948.

 5. BENEFICIOS DEL PROYECTO

El estrés salino y la sequía limita la productividad agrícola de manera muy importante. En el caso del tomate más del 30% de esta producción proviene de países Mediterraneos y se concentra en en regiones secas con clima cálido (FAO, 1995). Procesos naturales en tipos de suelos donde tiene lugar la producción de tomate producen suelos salinos y áridos de manera natural. Esto proyecto aportará datos fundamentales sobre mecanismos adaptativos de plantas glicófitas a estrés salino e hídrico. El conocimiento básico obtenido  será extrapolable a otras especies de interés comercial y por tanto dará lugar a aplicaciones en la agricultura.

La identificación del gen TOS1  determinará un elemento esencial en la sensibilidad a ABA. Si bien la búsqueda de mutantes en Arabidopsis que determinen genes implicados en la percepción o en la transmision de señal de ABA ha sido muy extensa, se ha identificado un número muy reducido de mutantes con una respuesta a ABA alterada. No se ha encontrado ningún mutante con las características que presenta tos1: recesivo, hipersensible a ABA en todos los órganos y estadíos de desarrollo de la planta y no implicado en la biosíntesis de ABA. Si bien el cribado de 2000 familias M2 mutagenizadas usando NaCl ha permitido la identificación de 9 mutantes tss, el cribado con manitol sólo ha identificado el mutante tos1. Todo esto justifica sobradamente clonación de este gen. Si bien la dificultad para clonar genes usando mapeo posicional no es tan fácil como en Arabidopsis el desarrollo de la técnica de AFLP y la alta densidad de marcadores en el mapa genético de tomate lo ha facilitado enormemente.

Del mismo modo, la identificación del mutante dry1 ha permitido identificar un componente esencial en la adaptación a condiciones hídricas adversas. La clonación de DRY1, permitirá identificar y estudiar este componente así como permitirá su evaluación biotecnológica. Particularmente interesante será la expresíon de este gen bajo un promotor inducible por estrés salino y osmótico como RD29A. Es esperable que la expresión de DRY1 bajo este promotor produzca una mayor tolerancia a estrés hídrico en Arabidopsis. Estos estudios permitirá evaluar el potencial que este gen pueda tener en plantas de interés comercial

Esta línea de investigación está financiada por el proyecto BIO2005-04733 concedido por el Ministerio de Educación y Ciencia y Confinanciado con Fondos Feder